АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

ЗАНЯТИЕ 11. Тема:Генетика микроорганизмов

Читайте также:
  1. VIII занятие.
  2. X занятие.
  3. XII занятие.
  4. АЦ – 7, занятие 1,
  5. ВВОДНОЕ ЗАНЯТИЕ
  6. ВВОДНОЕ ЗАНЯТИЕ
  7. Влияние занятием йоги на состояние человека
  8. Глава 1. Первое практическое занятие по методу ПМТ
  9. Групповое занятие.
  10. Десятое занятие
  11. З) Занятие по решению задач
  12. Заблуждение No 2. Силовой спорт - занятие только для молодых.

 

Тема: Генетика микроорганизмов. Медицинская биотехнология. Генетическая инженерия.

Студент должен знать:

- Фенотипическую и генотипическую изменчивость микроорганизмов.

- Мутации. Генетические рекомбинации у бактерии: трансформация, трансдукция, коньюгация.

- Плазмиды.

- Основные направления медицинской биотехнологии.

- Методы генетической и клеточной инженерии, их использование в диагностике и лечения; получение лечебных, профилактических и диагностических препаратов.

- Методы картирования генов.

Уметь:

- Поставить опыт и учесть результаты опытов трансдукции, трансформации, трансдукции.

- Владеть принципами молекулярной гибридизации, полимеразной цепной реакции, получение интерферона, инсулина методами генной инженерии и МКА с помощью гибридомной технологии.

 

Вопросы для проверки исходного уровня знаний

1. Организация генетического аппарата у бактерий. Бактериальная хромосома и плазмиды. Генотип и фенотип.

2. Мутации спонтанные и индуцированные. Каков молекулярный механизм мутаций? Какие вы знаете мутагены?

3. Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?

4. Генетические рекомбинации. Что такое трансформация?

5. Трансдукция и какими свойствами обладает трансдукцирующий фаг? Трансдукция специфическая, неспецифическая, абортивная.

6. Что такое коньюгация бактерий? Как она осуществляется? Основные функции F -фактора.

7. Понятие о внехромосомных носителях генетической информации.ции. Плазмиды. Классы плазмид.

8. Типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий? Какими свойствами обладают R -плазмиды?

9. Что такое бактериоцины? Гены, детерминирующие бактериоциногенность. Каковы основные свойства Col- плазмид?

10. Основные направления развития медицинской биотехнологии.

11. Проблемы конструирования клетки с новыми свойствами. Селекция микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ.

12. Методы генетической инженерии. Получение интерферона, инсулина, гормона роста, интерлейкинов, субьединичных вакцин.

13. Принципы постановки и примеры использования методов МГ и ПЦР.

14. Клеточная инженерия. Гибридомная технология и получение МКА.

15. Способы картирования бактериальных хромосом и плазмид.

16. Проблемы создания новых лекарственных форм. Иммобилизации антибиотиков на липосомах.

Самостоятельная работа студентов

Задание 23. Рассмотреть S - и R -колонии на демонстрационных чашках.

Описание представить в альбомах.

 

Задание 24. Генетические рекомбинации у бактерий:

- Коньюгация: постановка опыта скрещивания Нfr x F у кишечной палочки. (Демонстрация).

- Специфическая трансдукция: постановка опыта передачи локуса " gal " с помощью умеренного фага «лямбда» у кишечной палочки. (Демонстрация).

- Трансформация: демонстрация опыта передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis.

- Плазмиды: демонстрация электронограмм различных плазмид.

- Результаты продемонстрированных опытов с описанием и объяснениями представить в альбомах.

Методические указания к выполнению работы

Рассмотреть рост колоний биохимических мутантов на демонстрационных чашках. Ауксотрофные мутанты - биохимические мутанты, требующие присутствия в питательной среде факторов роста (аминокислот, витаминов), в которых не нуждаются клетки исходного (дикого) типа, называемые прототрофами. Прототрофыспособны размножаться на полноценных средах, но не могут расти на минимальных. Для того, чтобы ауксотрофный мутант размножался на минимальной среде, в нее должен быть добавлен фактор роста (или несколько различных факторов), в которых данный ауксотроф нуждается, поскольку сам не может синтезировать. Для получения ауксотрофных мутантов с помощью «пениициллинового» метода на исходную (прототрофную) культуру воздействуют мутагенными факторами - ультрафиолетовыми лучами или химическими мутагенами. Затем обработанную таким образом культуру выращивают в полноценной среде, в которой размножаются как прототрофные, так и ауксотрофные клетки. Размножившиеся бактериальные клетки отмывают и переносят в минимальную среду с добавлением пенициллина, где могут размножаться только клетки-прототрофы. Под действием пенициллина эти растущие клетки погибают. Ауксотрофные мутанты, не способные к делению на минимальной среде. Для проверки на ауксотрофность колонии высевают паралельно на минимальные и полноценные среды (удобно пользоваться методом «реплик»). Выделенные ауксотрофы идентифицируют, т.е. определяют необходимый фактор роста.
Генетические рекомбинации
Это обмен генетического материала мужду бактериями путем встраивания фрагмента хромосомы бактерии донора в хромосому бактерии рецепиента в процессе трансформации, трансдукции или коньюгации. Образующиеся рекомбинанты несут хромосому рецепиента, в которую включаются только отдельные фрагменты хромосомы донора (в этом существенное отличие от полового процесса эукариотов, потомство которых получает полных хромосомный набор обоих родителей).
1. Конъюгация - передача генетического материала от бактерий доноров к реципиентам путем их непосредственного контакта. Поставить опыт коньюгации по передаче маркеров «pro», «thr»-«leu» в скрещивании типа Hfr x F у кишечной палочки, для этого в опыт берут: 1) E.coli с Hfr - донор с генотипом pro+, thr+, leu+, str чувствительный; 2) культуру-рецепиент с генотипом pro-, thr-, leu-,str thr - leu. Получение бактериальных культур. Суточные культуры пересевают на бульон и выращивают при хорошей аэрации в течение 3-х часов. Опыт коньюгации проводят в чашках с селективной средой – минимальным агаром с добавлением глюкозы и стрептомицина. Постановка опыта коньюгации 1. В опытную пробирку в отношении 1:10 вносят культуру донора (0,1 мл) и реципиента (0,9 мл). Скрещиваемую смесь инкубируют при 37 С в течение 30 минут. Этого времени достаточно для вхождения проксимальных маркеров pro, thr, leu. При необходимости передачи всех хромосомы смесь выдерживают 2 часа. 2. Ставят два контроля: донора и рецепиента. Обе культуры разводят в 100 раз (0,1 мл культуры + 9,9 л физиологического раствора) и высевают по 0,1 мл на чашки с селективной средой, на которой они расти не могут, т.к. культура-донор чувствительна к стрептомицину, а рецепиент является ауксотрофом. 3. После инкубации скрещиваемую смесь разводят на 100 раз физиологическим раствором и засевают в обьеме 0,1 мл на селективную среду, на которой будут расти только прототрофные рекомбинанты. Опыт коньюгации учитывают через 24-48 часов. На контрольных чашках роста быть не должно, на опытной чашке вырастут рекомбинанты, число которых подсчитывают.
2. Трансдукция - перенос генетического материала от бактерий доноров к реципиентам с помощью трансдуцирующего фага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию и специфическую. При неспецифическую фаг (Р1, Р22) может включать различные фрагменты бактериальной хромосомы и передавать их клеткам-реципиентам, При специфической трансдукции возможен перенос только строго определенных генов. Специфически трансдуцирующим фагом является фаг «лямбда», который способен переносить гены «gal» и «bio». Опыт по передаче «gal» маркера кишечной палочке В опыт берут: 1) трансдуцирующий фаг «лямбда», выделенный из лизогенной культуры донора E.coli gal+ путем индукции УФ-светом; 2) культуру E.coli gal- реципиент. Опыт проводят на чашках с селективной средой, содержащей галактозу (среда ЭМС с индикатором эозин + метиленовый синий). Постановка опыта трансдукции 1) В опытную пробирку вносят 0,9 мл 3-часовой бульонной культуры-реципиента и 0,1 мл фаголизата трансдуцирующего фага «лямбда» в концентрации 10 частиц/мл (множественность инфекции 1,0). Смесь выдерживают при 37 0С в течение 30 минут. 2) Ставят 2 контроля: фаголизата на стерильность и культуры-реципиента, высевая их по 1,0 мл на чашки с селективной ЭМС-средой. 3) После инкубации делают высев 0,1 из опытной пробирки с трансдуцирующей смесью на чашку с селективной ЭМС-средой. Опыт учитывают через 48 часов. В контроле фаголизата рост должен отсутствовать. В контроле культуры-реципиента, не расщепляющей галактозу, микробы должны расти в виде бесцветных колоний. На опытной чашке вырастают окрашенные колонии трансдуктантов на фоне прозрачных, бесцветных колоний культуры-реципиента.
3. Трансформация - изменение свойств бактерий реципиентов под влиянием ДНК, выделенной из бактерий доноров, то есть непосредственная передача фрагмента ДНК донора клетке-реципиенту. Учесть опыт передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis. В опыт были взяты: 1) ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культуры-донора; 2) стрептомициночувствительная культура-реципиент (в компетентном состоянии). Опыт поставлен на чашках с МПА, в который добавлен стрептомицин в количестве 100 ед/мл. Постановка опыта трансформации Культуру компетентных клеток соединяют в равных обьемах с ДНК (напри–мер, по 0,5 мл). Выдерживают смесь в термостате 30 минут для контакта, после чего проводят высев на чашки с МПА и стрептомицином - по 0,2 мл смеси. Ставят 2 контроля: 1) высев на чашку ДНК и 2) высев стрептомицино–чувствительной культуры-реципиента. Опыт учитывают через 24-48 часов. В обоих контролях рост должен отсутствовать, на опытных чашках вырастают колонии трансформантов, которые приобрели признак стрептомициночувствительности. 4. Плазмиды - внехромосомные генетические структуры бактерий, представляющие собой циркулярные молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Плазмиды располагаются в цитоплазме бактериальной клетки, некоторые могут включаться (интегрировать) в хромосому.

 


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.003 сек.)