АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Направленная дифференцировка ЭСК и ППК in vitro

Читайте также:
  1. Агрессия, направленная на себя
  2. Гипоплазия яичка, клеточная индукция, дифференцировка, пролиферация, апоптоз
  3. ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОЛИТИКА, НАПРАВЛЕННАЯ НА УСКОРЕНИЕ ЭКОНОМИЧЕСКОГО РОСТА
  4. Дифференцировка aureus от epidermiyis, saprophyticus
  5. Дифференцировка мезодермы
  6. Дифференцировка цитоплазмы яйца после оплодотворения
  7. Клеточная индукция, дифференцировка, апоптоз, миграция.
  8. Клеточная индукция, пролиферация, дифференцировка, апоптоз, адгезия, перемежение клеток.
  9. Корреционно-развивающая программа, направленная на снятие агрессии у младших школьников.
  10. Лекция № 2. Здоровый образ жизни как система индивидуального поведения человека, направленная на сохранение и укрепление здоровья
  11. Логистическая операция - обособленная совокупность действий, направленная на преобразование материального и/или информационного потока.
  12. Медицинская деятельность, направленная на профилактику НИЗ и формирование ЗОЖ

Ранее всего спонтанная дифференцировка ЭСК была изучена в культуре тератокарциномы. Недостаток линий ТК в том, что они быстро теряли способность дифференцироваться в стандартно воспроизводимые фенотипы соматических клеток. Первой была описана дифференцировка эмбриокарцином в крупные распластанные клетки (в культуре с низкой плотностью клеток). Часть полиплоидных клеток синтезировала хорионический гонадотропин, что делало фенотип похожим на клетки трофобласта. Далее были найдена линия NTERA2, на которой удалось детально изучить нейрогенез под влиянием ретиноевой кислоты. Этот проект закончился первым в истории биологии получением лабораторных нейронов и их дальнейшим использованием в клинике для лечения последствий инсульта, травм спинного и головного мозга, а также нейродегенеративных заболеваний. (подробности см. www.biolayton.com).

Первые итоги лабораторного получения дифференцированных клеток из ЭСК были резюмированы в 1996 г (Weiss M., Orkin S.D., 1996). Инкубация клеток тератокарциномы F9 или P19 с тщательно подобранной концентрацией цАМФ и ретиноевой кислоты вызывала индукцию висцеральной эндодермы (желточного мешка). Клетки этого зачатка в культуре синтезировали фетуин, альфа-фетопротеин и альбумин. Те же клетки тератокарциномы созревали в гематогенные линии при добавления IL-3 и супернатанта фидера от стромальных клеток. Полагали, что фидер продуцировал следующие сигналы для созревания гематогенных линий: IL-3, SCF, bFGF, IGF-1, IL-6, GCSF.

Репертуар дифференцировки линий ЭСК Томсона в соматические клетки in situ богаче, чем лабораторная дифференцировка ЭСК тератокарциномы (Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A., 2001). Выращенные в плотной культуре ЭСК человека (особенно при редкой смене фидера) снижали темп пролиферации и начинали спонтанно дифференцироваться. Сохранение плюрипотентности связано с поддержанием синтеза ID – ингибиторов дифференцировки (Nogieira M.M., Mitjavila-Garcia M.T., LePasteur F. et al., 2000). Первыми в таких «стареющих» культурах появлялись клетки экстраэмбриональной энтодермы, а также экспрессировались гены зародышевых листков (Reubinoff B.M., Pera M.F., Fong C. et al., 2000).

Кроветворение in vitro в клоногенной культуре ЭСК начиналось при соблюдении двух условий: 1) из среды культивирования убирали LIF 2) создавали контакт эмбриоидных телец с клетками стромального фидера. В необработанных культурах кроветворение сочеталось с васкулогенезом. Внутри эмбриоидных телец вопроизводились события, происходящие в желточном мешке: формировалпсь сети ангиобластов с островками первичного кроветворения. Только крупные ангиобласты формировали капилляры de novo (васкулогенез). Позднее капиллярная сеть росла лишь за счет краевого роста (sprouting) эндотелиальных клеток. В культуре ЭСК удалось наблюдать раздельно образование капилляров и островков кроветворения.

Большинство гематогенных стволовых клонов, полученных из ЭСК, не имели клинической перспективы, поскольку имели укороченные сроки обновления in situ. Сокультивирование «лабораторных» гематогенных колоний с гематогенной стромой возвращало потенцию клонам как к длительному самообновлению in viro, так и длительному выживанию в гематогенной ткани реципиента (Wang S., Gaerhart J.D., 2000).

Рис 1-10 Образование гематогенных клонов из эмбриодных телец ЭСК мыши

Для получения гематогенных стволовых клеток эмбриоидные тельца механически дезагрегировали в однородную клеточную популяцию. Затем клетки культивировали методом "висячей капли", либо помещали на метилцеллюлозу с добавлением цитокинов и ростовых гематогенных факторов. Показано, что ЭСК, трансфецированные двойной дозой гена Hox-B4, троекратно увеличивали скорость наработки предшественников миелоидного и эритроидного ряда in vitro.

Обращало внимание, что синхронное образование предшественников кроветворения и эндотелия in vitro происходило не через мезенхиму и мезенхимальные стволовые клетки (как это происходило in situ). В зародыше взаимодействие стромы и гематогенных стволовых клеток предопределяло образование полноценной кроветворной ткани с длительно живущими самообновляемыми ростками миело- и эритропоеза. Возникновение очагов кроветворения из ЭСК сопровождалось частичной дифференцировкой островков кроветворения в линии так называемых эмбриональных макрофагов. Линии макрофагов, возникающих из кроветворных клонов желточного мешка имели фенотипические особенности. Эти клетки не принимали участия в презентации антигенов, но обеспечивали удаление погибающих клеток из провизорных клонов. После рождения такие транзиторные линии макрофагов полностью исчезали из кроветворной ткани (Inamdar M., Roch T., Rapoport R. еt al., 1997). Продемонстрирована дифференцировка клонов ЭСК мышей на специальном фидере без нескольких ростовых факторов, блокирующих эритропоэз и миелопоэз, в гетерогенную популяцию пре-В-лимфоцитов с характерными маркерами созревания (CD 19, CD24, CD117, CD45R+). C помощью рекомбиназы клетки на поверхности собирают иммуноглобулины из мРНК V,D, и J локусов. Индуктором дифференцировки являлся лиганд рецептора FLt3 (Cho S.K., Webber T.D., Carlyle J. et al.,1999)

Для индукции нейрогенеза из ЭСК in vitro из среды убирали LIF и фидер. Далее частично прикрепленные к подложке постмитотические клетки обрабатывали 100нмоль ретиноевой кислоты с добавкой 1% телячей сыворотки (FCS). Эффективность начальных этапов нейрогенеза контролировали по экспрессии мРНК двух генов: Рах-6 и SHH. Исчезновение мРНК гена SHH коррелировало с остановкой митозов прогениторных популяций. Включение гена Рах-6 маркировало начало рестрикционного созревания нейронов.

Линия тератокарциномы человека NT2 генерировала более 80% постмитотических нейронов после добавления в культуральную среду 10 мкг/мл ретиноевой кислоты в течение 6 нед (пропись фирмы BioLayton). Однако такой выход нейронов удавалось получить только из культуры, в которой сперва отсортировывались нестин+ НСК. Если получали нейроны из общей массы предшественников, эффективность процедуры оставалась на уровне 10-30 %. С помощью иммунофенотипических маркеров однородную популяцию зрелых постмитотических нейронов высортировывали с помощью поточного сортировщика клеток от остатков незрелых клеток. Как показали многократные эксперименты на животных, такие нейроны после трансплантации в мозг не только выживали, но и встраивались в региональные нейронные сети. В экспериментах на животных с модельным дефектом ЦНС обнаружены позитивные эффекты нейротрансплантата на симптоматику заболевания (последствия травмы, инсульта, димиелинизирующие заболевания, наследственные дефекты развития мозжечка, болезни отложения липидов и полисахаридов и т.п.). Эти вопросы подробно рассмотрены во второй главе книги.

Пока лишь фрагменты программ для направленной дифференцировки ЭСК человека in vitro попали в открытую печать. Установлено, что нейрогенные эффекты ретиноевой кислоты in vitro нужно оценивать по экспрессии гена Wnt-13. Сама ретиноевая кислота стимулировала образование функционально незрелых нейронов с недоразвитой сетью синапсов и без электровозбудимой мембраны. Прединкубация таких незрелых нейробластов с средой культивирования зрелых астроцитов завершала дифференцировку тел нейронов и их медиаторную специализацию. Хотя лабораторно полученные нейроны человека из ЭСК уже начали использоваться в клинических испытаниях, научная база рестрикционного созревания ЭСК в нейроны только формируется. Детали "software" для лабораторного нейрогенеза строго засекречены и приватизированы частными фирмами. По-видимому, от идеи «один сигнал - один фенотип» приходится отказаться. Рестрикционное созревание любой соматической линии клеток находится под контролем множества сигналов.

В культуре НСК из фетального мозга добавление 0,5 мкмоль ретиноевой кислоты в три раза усиливало скорость созревания нейронов (в контроле среда содержала только bFGF). Если ретиноевая кислота ускоряла индукцию master-genes (NeuroD, Hu, NeuN, p21), то нейротрофины (BDNF, NT-3, NGF) завершали второй этап дифференцировки нейронов формированием "профиля" нейромедиаторов. BMP-2 и BMP-4 необходимы для терминальной специализации нейронов. Показательно, что дифференцировка ЭСК в нейроны in vitro шла иными путями, чем созревание нейронов in situ.

Общепризнанно, что в зародыше все популяции нейронов и глии образуются из нейральных стволовых клеток (НСК), первично возникших в эпендиме/субэпендиме развивающейся нервной трубки. Все НСК возникают в ходе гаструляции из клеток первичной эмбриональной эктодермы, получающей индуктивные сигналы от организатора (мезоэнтодермы) (Tropepe V., Hiftoshi S., Sirard C. et al., 2001). НСК в нервной трубке отличаются характерными маркерами: polysyalated-NCAM - поверхностный маркер незрелого нейроэпителия; нестин, виментин - белки промежуточных волокон нейроэпителия. Другой ранний белок- glial fibrillar acidic protein (GFAP) – преимущественно метил субэпендимальные НСК, особенно латерального желудочка мозга (Alvarez-Buyilla, 2000). За последние годы стало ясно, что НСК можно получать из ЭСК альтернативным путем, не повторяя событий in situ.

Получить редкие колонии НСК в плотной культуре ЭСК удалось остановкой пролиферации в бессывороточной среде с добавлением 1мкмоля ретиноевой кислоты. Через 1 нед появлялись типичные нейросферы, клетки которых окрашивались антителами к нестину, виментину и polysyalated-NCAM. Еще через 1 нед в нейросферах появлялись клетки, экспрессирующие мРНК гена Рах-6. Когда позже сферы прикреплялись к подложке, распластанные вытянутые клетки формировали отростки и были идентифированы как нейробласты с помощью антител к МАР-2, NeuN, betaIII-tubulin. На заключительных стадиях созревания формировались лиганд- и потенциал-зависимые ионные каналы, рецепторы и белки синаптической мембраны. Получены однородные популяции предшественников олигодендроцитов из ЭСК. Трансплантация лабораторно полученных предшественников олигодендроглии стимулировала ремиелинизацию в поврежденном мозге животных (Brustle O, Jones K, Lerish R, et al., 1999; Liu S., Qu Y., Stewart T.J. et al., 2000).

Серийный анализ генной экспрессии (SAGE) выявил наиболее важные сдвиги экспрессии генов (активация или выключение синтеза мРНК) в трех отсеках генома: энергетика, метаболизм и сигнализация. В незрелых пролиферирующих ЭСК отмечена ограниченная экспрессия генов сигнализации (рецепторы, G-белки, вторичные мессенжеры, транскриптазы, кофакторы экспрессии и репрессии). Из 588 исследованных генов сигнализации в ЭСК менее половины оказались экспрессированными. Методом SAGE показано, что при начальной индукции нейрогенеза ретиноевой кислотой происходило синхронное выключение 18 "старых" генов, работающих в ЭСК. Одновременно, включались 61 новых генов "сигнализации". Учитывались самые мощные сдвиги экспрессии, когда уровень мРНК возрастал или снижался в 2.5 раза и более. Первыми в ЭСК включались гены, контролирующие рецепторы клеточной адгезии, компоненты экстрацеллюлярного матрикса, рестрикционные транскриптазы и компоненты «кабеля транссигнализации» между ядром и рецепторами. Выключению подвергались гены-сайленсеры и коингибиторы генной экспрессии, удерживающие геном в неактивном, либо тотипотентном состоянии (Kelly, Rizzino, 2000)

В ранних работах спонтанно сокращающиеся кардиомиоциты получали из ЭСК мышиных тератокарцином путем добавления в среду культивирования диметилсульфоксида (ДМСО). Позднее стало известно, что ДМСО играет роль вектора для доставки гидрофобных сигналов (ретиноевая кислота, цитокины с гидрофобными доменами) в ядро стволовых клеток. Более эффективно кардиомиоциты получают сейчас под контролем экспрессии гена Crypto. Уже говорилось, что этот ген контролирует нормальное формирование founder cells в эпибласте. Линии ЭСК Crypto-/- теряли способность генерировать зачаток сердца. Накопление кислородных радикалов и электрическая стимуляция ЭСК в культуре ускоряли образование зрелых спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов. Такие кардиомиоциты, полученные в лаборатории, активно встраивались в миокард развивающихся зародышей, либо в постишемическую поврежденную ткань (Doevendans P.A., Kubalak S.W., An R.H. et al, 2000; Kehat I. et al., 2001).

Многие специализированные линии клеток (адипоциты, клетки поджелудочной железы, островки Лангерганса, клетки эндокринных желез, иммунной системы) не возникали спонтанно из ЭСК при блокаде клеточной пролиферации. Большинство исследователей получали адипоциты из линий стромальных клеток мезодермального происхождения (типа 10T1/2) (Dani C., Smith A.G., Dessolin S., et al, 1997).

Только некоторые линии ЭСК тератокарциномы (E14TG2a, CGR8, ZIN40) трансформировались в адипоциты при добавлении ретиноевой кислоты, растворенной в ДМСО. Если микромолярные концентрации ретиноевой кислоты ингибировали адипогенез, то наномолярные концентрации ретиноевой ксилоты были эффективными индукторами жировых клеток (до 30-60 % от всех клеток в культуре). Предполагают, что ретиноевая кислота вызывает образование мультипотентных мезенхимальных клонов в культуре, которые далее по разным программам повторяют адипогенез, миогенез, кардиогенез уже с помощью набора сигналов и генов «второго эшелона» Низкие «адипогенные» концентрации ретиноевой кислоты не влияли на экспрессию генов Brachyury, Zeta-globin, Nkx5-2, кардиоспецифичную изоформу актина. Наоборот, высокие «кардиогенные» концентрации ретиноевой кислоты, блокируя адипогенез, стимулировали экспрессию генов мезодермы, кардиогенной мезодермы, генов созревания кардиомиоцитов (Dani C., Smith A.G., Dessolin S. et al., 1997).Для этой трансформации существовал узкий временной диапазон (критический период), когда не только витамин А, но и стимуляторы пероксисом, Т3 (трииодтиронин) и индукторы липогенеза ускоряли образование преадипоцитов в культуре. Фенотип преадипоцитов определяли по появлению транспортных белков для жирных кислот и синтазе триглицеридов.

Как известно, хондроциты в ходе эмбриогенеза образуются из сомитов и мезодермы через множество промежуточных структур костно-мышечной системы. Источником хряща являются мезенхимальные стволовые клетки. Однако с помощью ЭСК удалось вопроизвести рестрикционное созревание хондроцитов в обход главных событий органогенеза, взаимодействий склеротомов и нотохорды, не повторяя сложных эпителиомезенхимальных взаимодействий. Кажется удивительным, что эмбриоидные агрегаты ЭСК в простых условиях культуры способны дифференцироваться в хондроциты вне формирования зачатка конечности и других провизорных структур зародыша. ЭСК наращивали стандартным методом в суспензии над фидером в среде Дульбекко-Игл с15% FSC (HyClone). Выращенные агрегаты переносили на малтивеллы с дном, покрытым желатиной, и клетки переносили в среду для дифференцировки. Главными сигналами хондрогенеза было сочетание концентраций ВМР-2, ВМР-4 и TGF-beta. Исследование спектров мРНК показало, что первый этап дифференцировки сопровождается активацией генов Sox-9, Pax-1 – маркеров мезенхимальных стволовых клеток. На втором этапе активировалась транскриптаза scleraxisи и начинался синтез коллагена II типа. Третий этап созревания оценивали по накоплению специфического протеогликана- агрекана (Kramer J., Hegert C., Guan K. еt al., 2000). Самая важная особенность хондроцитов, полученных из ЭСК, - их уникальная способность сохранять фенотип дифференцированных клеток при длительном культивировании. Как известно, хондроциты в первичной культуре, выделенной из фетального или взрослого хряща, дедифференцируются в фибробласты за 7-15 дней. Возможно, эта особенность лабораторно полученных хондроцитов найдет практическое применение в медицине.

В заключение следует подчеркнуть, что лабораторное получение нейронов, кардиомиоцитов и других соматических клеток человека из ЭСК идет в обход важнейших событий эмбриогенеза: 1) взаимодействия мезенхимы с провизорными клонами и тканями трех зародышевых листков 2) в обход региональных программ рестрикционного созревания нейронов и глии, когда источником локальных сигналов служила мезенхима. Полную картину ранних стадий эмбриогенеза невозможно вопроизвести на изолированных линиях ЭСК без организованного роста мезенхимы и провизорных органов. Например, из линий ЭСК не удается получить клетки нервного гребня in vitro. Лишь часть ранних событий органогенеза воспроизводится хаотически в культуре «эмбриоидных телец». Поскольку созревание линий дифференцированных клеток изначально идет в простых средах, полученные нейроны, кардиомиоциты, хондроциты способны стабильно сохранять фенотип в лабораторных условиях. Между тем добиться длительного сохранения фенотипа тех же клеток в культуре, изолированных из органов взрослых животных млекопитающих и человека, часто оказывается невозможным. Трансплантация дабораторно полученных нейронов/нейробластов в организм животных, подтверждает их функциональную полноценность, в том числе как средства биорепарации повреждений in situ. Существенно, что рестрикционное созревание нейронов, гепатоцитов, кардиомиоцитов может идти в культуре «отдельным пакетом» вне морфогенеза и общих программ согласованного строительства зародыша. Более того, часть программ «линейного созревания» клеток идет только in vitro после дисперсии клеток-предшественников и устранения межклеточных взаимодействий, которые блокируют дифференцировку прогениторных популяций. Например, многие программы дифференцировки клеток блокированы в «эмбриоидных тельцах», но идут после дезагрегации клеток.

Дифференцировка ЭСК в специализированные классы соматических клеток открывает беспрецедентные возможности для изучения функциональных программ генома. Предстоит понять, почему в лабораторных условиях существуют десятки способов получения функционально зрелых нейронов или кардиомиоцитов с помощью разных сигналов и генов (Wernig M., Brustle O., 2002). Возможно, что разные способы сборки молекулярных машин и транскрипционных комплексов ведут к неидентичному функциональному результату, т.е. не жестко запрограммированному ответу клеток.

 


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.005 сек.)