ЗАДАНИЕ № 2. Техника окраски по Граму

ИНСТРУКЦИЯ К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 4

ТЕМА: Микроскопический метод диагностики.

ЦЕЛЬ:

Сформировать знания у учащихся о сложном методе окраски. Изучить технику окраски по Граму.

ЗАДАНИЕ № 1. Сложные методы окраски.

Более длительные методы, где используются два и более красителей. С помощью сложных методов окраски можно изучить форму микробов, размеры, а также структуру клетки (наличие спор, капсулы, жгутиков и т.д.).

ЗАДАНИЕ № 2. Техника окраски по Граму.

Техника окраски по Граму:

Подготовительный этап:

1. Подготовить рабочее место согласно правил работы в лаборатории.

2. Подготовить и привести микроскоп в рабочее состояние согласно правил работы с микроскопом.

3. Подготовить емкость с дез. средством для обеззараживания препаратов согласно инструкции.

Основной этап:

1. На препарат кладут фильтровальную бумагу и наносят несколько капель раствора кристалвиолета на 2 минуты. Затем снимают бумагу и промывают водой.

2. Сливают лишнюю воду и наливают на препарат раствор Люголя выдерживают до почернения мазка, промывают водой.

3. Сливают воду и опускают в 96˚ спирт на 30-60 секунд до отхождения фиолетовых струй, (т.е. обесцвечивают препарат).

4. Промывают препарат водой.

5. Наливают фуксин Пфейффера на 2 минуты. Промывают водой и высушивают препарат фильтровальной бумагой. После чего микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делятся на две группы грамположительные (окрашиваются в фиолетовый цвет) и грамотрицательные (окрашиваются в красный цвет). Окраска зависит от строения стенки бактерий.

Техника окраски по Цилю - Нильсену:

1. Фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, на которую наносят фуксин Циля, и несколько раз подогревают над пламенем спиртовки до появления паров, подливая краситель, далее бумагу снимают и промывают водой;

2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты и промывают водой;

3. На мазок наливают водно-спиртовой раствор метиленового синего, спустя 3-5 минут промывают водой и высушивают – кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно - красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, - в светло-синий цвет.

Окраска капсул по методу Бурри – Гинса:

1. В каплю туши, разведенной 10 раз водой, вносят исследуемые бактерии и равномерно распределяют их петлей по предметному стеклу.

2. Мазок высушивают и фиксируют (наносят 2-3 капли спирта и сжигают его на стекле);

3. Окрашивают в течение 3-5 минут фуксином Пфейффера, промывают водой, высушивают. На темном фоне препарата капсулы видны в виде светлых ореолов вокруг красных бактерий.

Обнаружение жгутиков:

Под иммерсионным микроскопом жгутики становятся видимыми лишь после специальных методов их протравливания солями серебра или ртути.

О наличии жгутиков чаще всего судят по направленному характеру движения бактерий в раздавленной и висячей каплях при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Раздавленная капля:

1. На середину предметного стекла наносят каплю суточной бульонной культуры бактерий и осторожно накрывают ее покровным стеклом так, чтобы жидкость не растекалась за его края и в нее не попадали пузырьки воздуха.

Висячая капля:

1. Каплю бактерий наносят на середину покровного стекла и накладывают на него специальное предметное стекло с лункой, смазанное вокруг нее вазелином так, чтобы капля находилась в центре углубления.

2. Препарат осторожно переворачивают, и капля свисает в герметически закрытой полости.

Раздавленную и висячую капли микроскопируют при опущенном конденсоре, регулируя поступление света вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением, затем сухим объективом (х40), и иммерсионным. Лучшие результаты дает микроскопия в темном поле или в фазовом контрасте.

Окраска спор:

Чаще для окрашивания спор используется метод по Пешкову:

1. На фиксированный мазок наливают метиленовый синий Леффлера.

2. Нагревают препарат в средней части пламени, кипятят 15-20 сек, не допуская высыхания.

3. Остывший препарат промывают водой, докрашивают 30 сек 0,5 % раствором нейтрального красного, затем снова промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в голубовато синий цвет, тело бацилл и клостридий – в розовый.

Заключительный этап:

1. Дезинфекция и уборка рабочего места.

2. Дезинфекция и мытье рук.

Контрольные вопросы:

1. Чем отличается простой метод окраски от сложного?

2. Техника окраски по Граму?

3. На какие две группы делятся микробы по окраске по Граму?

4. Техника окраски по Цилю-Нильсену.

5. Обнаружение жгутиков с помощью микроскопии.

6. Техника окраски капсул по методу Бурри-Гинса.

7. Окраска спор по методу Пешкова.

8. Какие основные формы бактериальной клетки вам известны?

9. Капсула микроорганизмов, ее роль в организме человека и животных. Методы обнаружения капсулы.

10. Характеристика жгутиков. Группы бактерий по типу расположения и числу жгутиков. Метод обнаружения жгутиков.

11. Спора. Назначение споры. Метод обнаружения споры.

12. Техника микроскопии раздавленной и висячей капли.

13. Группы бактерий по типу дыхания.

14. Основные функции клеточной стенки бактерий. Особенности окраски грамположительной и грамотрицательной клеточной стенки.

15. L- формы бактерий их характеристика.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Ф.К. Черкес; Л.Б. Богоявленская; Н.А. Бельская "Микробиология" изд. Москва Медицина, 1986г.

2. А.С. Лабинская "Микробиология с техникой микробиологической диагностики" изд. Москва Медицина, 1968г.

3. Н.А. Бакулина; Э.Л. Краева "Микробиология", изд. Москва Медицина, 1980г.

4. С.А. Павлович «Микробиология с вирусологией и иммунологией» Минск «Вышэйшая школа» 2005г.

Поиск по сайту: