Етапи ДНК-діагностики з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

Сьогодні одним з основних етапів ДНК-діагностики є полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Метод було розроблено в 1983 р. К. Мюллісом (США). За розробку цього методу в 1993 р. йому було присуджено Нобелівську премію в галузі біології і медицини.

Виділяють такі етапи ДНК-діагностики з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

1) Виділення ДНК. Як правило, ДНК з біологічного матеріалу виділяють методами лізису клітин з подальшим очищенням від білкових компонентів. Для підвищення чутливості реакції ДНК можна сорбувати на іонообмінних смолах.

2) Полімеразная ланцюгова реакція, яка дозволяє вибірково ампліфікувати багатократно редуплікувати) ділянку ДНК, що цікавить дослідника, в мільйони раз.

Необхідною умовою для проведення ПЛР є знання нуклеотидної послідовності ампліфікованої ділянки ДНК, оскільки специфічний вибір цієї ділянки здійснюється шляхом гібридизації матричної ДНК з двома штучно синтезованими праймерами. Праймери — олігонуклеотидні послідовності ДНК завдовжки від 15 до 30 п. о., комплементарні 3’-кінцям ампліфікованої ділянки на змістовій і антизмістовій нитках ДНК відповідно. Таким чином, відстань між праймерами визначає довжину синтезованих фрагментів ДНК.

По суті, метод ПЛР імітує природний процес редуплікації ДНК у клітинах. До складу реакційного розчину вводять ДНК обстежуваної людини, чотири види нуклеотидів ДНК (дезоксирибонуклеотид–трифосфати), а також термостабільну ДНК-полімеразу (Taq-полимеразу), яка зберігає свою активність при високій температурі. Цей фермент було виділено з бактерій, які живуть у гарячих джерелах (Thermus aquaticus). Оптимум роботи ферменту при температурі +72 °С.

Проведення реакції здійснюється в спеціальній буферній суміші з певними концентраціями іонів калію, хлору, магнію і точним значенням рН.

Полімеразна ланцюгова реакція відбувається циклічно. Кожен цикл має три фази:

1. Денатурація або плавлення – суміш нагрівають до 90–95 °С. При цьому відбувається розрив водневих зв’язків, що сполучають два ланцюги ДНК, і ДНК переводиться в однониткову форму.

2. Гібридизація, або відпал — суміш охолоджують до 45–60 °С, праймери з’єднуються з комплементарними ділянками ДНК.

3. Синтез — суміш знов нагрівають до 72 °С, починає працювати термостабільна ДНК-полімераза і синтезується дочірній ланцюг ДНК. ДНК-полімераза добудовує нитку нуклеотидів комплементарно матричній ДНК. Причому синтез ДНК йде від місця гібридизації праймера у напрямі 3’–5’. При цьому праймер включається до складу щойно синтезованої ділянки нуклеїнової кислоти. У подальших циклах щойно синтезовані молекули ДНК стають, у свою чергу, матрицею для аналогічного синтезу нових копій. Оскільки синтез кожного з двох антипаралельних ланцюгів ДНК розпочинається від місця гібридизації праймера, це місце і стає межею синтезованої ділянки (рис. 10.7).

Якщо уявити собі, що в реакційній суміші знаходилася одна молекула ДНК з ділянкою, яку необхідно редуплікувати, то після першого циклу одержують 2 молекули, після другого циклу — 4 і т. ін. Тобто кількість копій ДНК збільшується в геометричній прогресії.

ДНК

1 фаза 2 фаза 3 фаза

денатурація відпал синтез

праймер

Кількість вказаних циклів в ПЛР становить зазвичай від 25 до 30. У результаті кількість копій ДНК збільшується в мільйони разів.

Суміш ставлять у спеціальний прилад — термоциклер, або ампліфікатор. У ньому автоматично відбувається зміна температур, необхідних для реакції.

3) Аналіз одержаних результатів. Фрагменти з нормальною і мутантною послідовностями можуть відрізнятися за електрофоретичною рухливістю, тому часто проводиться електрофорез ампліфікованих фрагментів у гелі

Для ідентифікації ампліфікованих фрагментів можуть бути використані методи секвенування, а також метод алель-специфічних олігонуклеотидів. Метод алель-специфічних олігонуклеотидів грунтується на гібридизації ампліфікованих фрагментів ДНК з міченими олігонуклеотидами, комплементарними нормальній або мутантній послідовності ДНК. Прикладом такого підходу є застосування ДНК-чипів.

Поиск по сайту: